Next Generation Sequencing – Einige Hintergründe
Beim Next-Generation Sequencing (NGS) handelt es sich um ein modernes Verfahren zur parallelen Sequenzierung und computergestützten Analyse von DNA und RNA. In der Onkologie wird NGS unter anderem eingesetzt, um die molekularen Eigenschaften eines Tumors möglichst genau zu untersuchen.
Durch die Analyse des Tumorgenoms lassen sich genetische Veränderungen erkennen, die für das Wachstum und die Entwicklung eines Tumors eine Rolle spielen können. Diese Informationen können dabei helfen, die biologischen Eigenschaften eines Tumors besser zu verstehen und gezielt nach Veränderungen zu suchen, die therapeutisch relevant sein können.
Damit bildet NGS eine wichtige Grundlage der Präzisionsonkologie: Die Behandlungsart wird nicht allein danach entschieden, in welchem Organ ein Tumor entstanden ist, sondern zunehmend auch danach, welche individuellen molekularen Veränderungen in den Tumorzellen vorliegen.
Was ist das Genom?
Unter dem Genom versteht man die Gesamtheit der genetischen Information eines Lebewesens, vereinfacht ausgedrückt den biologischen „Bauplan“ des Körpers..
Beim Menschen liegt diese Information in den somatischen Zellen, also den Körperzellen, auf 23 Chromosomenpaaren vor. Das entspricht insgesamt 46 Chromosomen. Die Keimzellen – Eizellen und Spermien – enthalten dagegen nur einen einfachen Chromosomensatz mit 23 einzelnen Chromosomen. Sie sind daher haploid, während Körperzellen diploid sind.
Die Chromosomen bestehen aus DNA (Desoxyribonukleinsäure), die eng mit Proteinen, insbesondere Histonen, verbunden ist. Die DNA enthält zahlreiche Gene. Ein Gen ist vereinfacht ausgedrückt ein bestimmter Abschnitt der DNA, der an einer definierten Stelle – dem sogenannten Genlocus – liegt und die Information für ein funktionelles Produkt, beispielsweise ein Protein oder eine funktionelle RNA, enthält.
Chemisch besteht die DNA aus vier verschiedenen organischen Basen: Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C). Eine Base ist mit einem Zuckermolekül, der namensgebenden Desoxyribose, und einem Phosphatrest verbunden. Diese drei Bestandteile zusammen bilden ein Nukleotid, den Grundbaustein der DNA.
Die DNA liegt überwiegend als Doppelstrang in Form einer Doppelhelix vor. Die beiden Stränge sind über komplementäre Basen miteinander verbunden: Adenin paart sich mit Thymin (A–T), Guanin mit Cytosin (G–C). Diese Basenpaarung wird durch Wasserstoffbrückenbindungen ermöglicht. Die komplementäre Struktur erlaubt es der Zelle unter anderem, die genetische Information zuverlässig zu vervielfältigen.
Ein typisches protein-codierendes Gen enthält verschiedene funktionelle Bereiche. Dazu gehören beispielsweise regulatorische Bereiche wie der Promotor, der für den Beginn der Transkription eine wichtige Rolle spielt, sowie eine transkribierte Region mit Exons und – bei vielen Genen – Introns. Am Ende der Transkription sorgen sogenannte Terminationssignale dafür, dass die RNA-Polymerase die Transkription beendet. Die Exons enthalten die Abschnitte, die nach der RNA-Prozessierung in der reifen mRNA verbleiben. Bei protein-codierenden Genen enthalten sie die für das Protein relevanten codierenden Sequenzen. Introns werden dagegen während des Spleißens aus der Prä-mRNA entfernt.
Die Größe von Genen ist sehr unterschiedlich. Manche Gene umfassen nur wenige hundert Nukleotide, andere erstrecken sich über Millionen von Basen. Das menschliche Genom enthält rund 20.000 protein-codierende Gene. Hinzu kommen zahlreiche Gene, die funktionelle, nicht-protein-codierende RNAs hervorbringen. Die genaue Anzahl hängt daher auch davon ab, was man als Gen definiert und welche Genarten man berücksichtigt.
Die DNA befindet sich beim Menschen überwiegend im Zellkern. Ein kleiner Teil der genetischen Information liegt außerdem in den Mitochondrien vor.
Quellen:
https://www.genome.gov/genetics-glossary/Genome
https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Deoxyribonucleic-Acid-Fact-Sheet
Von der DNA zur RNA
Für die Umsetzung der genetischen Information spielt die RNA (Ribonukleinsäure) eine zentrale Rolle. Auch RNA besteht aus Nukleotiden. Ihr Zuckermolekül ist jedoch die Ribose, und anstelle der Base Thymin (T) enthält RNA Uracil (U). Die vier Basen der RNA sind daher Adenin (A), Uracil (U), Guanin (G) und Cytosin (C).
Bei der Transkription wird die Information eines DNA-Abschnitts mithilfe des Enzyms RNA-Polymerase in eine RNA-Sequenz übertragen. Bei einem protein-codierenden Gen entsteht zunächst eine sogenannte Prä-mRNA, die noch die Exons und Introns enthält.
Anschließend wird diese Prä-mRNA durch verschiedene Prozesse zur reifen mRNA verarbeitet. Dazu gehören unter anderem das sogenannte Spleißen, bei dem die Introns entfernt und die verbleibenden Exons miteinander verbunden werden, sowie das Anfügen einer 5′-Cap-Struktur und eines Poly(A)-Schwanzes. Diese Veränderungen tragen unter anderem zur Stabilität der mRNA und zu ihrer weiteren Verarbeitung und Nutzung in der Zelle bei.
Die reife mRNA kann anschließend den Zellkern verlassen und gelangt ins Zytoplasma. Dort wird ihre genetische Information an den Ribosomen in ein Protein übersetzt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet.
DNA und RNA unterscheiden sich dabei nicht nur in ihrer chemischen Zusammensetzung. DNA liegt unter physiologischen Bedingungen überwiegend als stabile Doppelhelix vor und dient vor allem als langfristiger Speicher der genetischen Information. RNA ist meist einzelsträngig und kann je nach Funktion sehr unterschiedliche Strukturen und Aufgaben übernehmen. Die mRNA dient dabei als vorübergehende Abschrift der Information eines Gens und bildet die Grundlage für die Herstellung bestimmter Proteine.
Quellen:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26887
NGS in der heutigen Onkologie
Man weiß heute, dass Krebs durch Veränderungen im Erbgut entsteht. Dabei können Gene verändert werden, die das Wachstum und die Teilung von Zellen kontrollieren. Bestimmte genetische Veränderungen können dazu führen, dass sich Zellen unkontrolliert vermehren und ein Tumor entsteht.
Beim NGS können sowohl die DNA als auch die RNA eines Tumors untersucht werden. Dazu wird in der Regel eine Gewebeprobe des Tumors analysiert. Ziel ist es, die molekularen Veränderungen des Tumors möglichst genau zu charakterisieren und herauszufinden, welche davon für sein Wachstum eine Rolle spielen könnten.
Damit hat sich die Onkologie in Richtung einer Präzisionsonkologie entwickelt: Statt sich ausschließlich an der Krebsart und dem betroffenen Organ zu orientieren, können zunehmend auch die individuellen molekularen Eigenschaften des Tumors berücksichtigt werden.
Quellen:
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9588890
https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing
https://www.cancer.gov/ccg/research/cancer-genomics-overview
https://www.esmo.org/insights-by-esmo
Was die Tumor-DNA verrät
Die Analyse der Tumor-DNA liefert Informationen über genetische Veränderungen, die im Erbgut der Tumorzellen vorhanden sind. Vereinfacht kann man von „dauerhaften Fehlern im Bauplan“ sprechen.
Damit ist gemeint, dass sich die DNA-Sequenz der Tumorzelle verändert hat. Wenn eine solche Veränderung in einer Tumorzelle vorhanden ist, wird sie bei der weiteren Zellteilung grundsätzlich an die Tochterzellen weitergegeben. Dadurch kann sich die Veränderung im Tumor ausbreiten.
Allerdings ist nicht jede gefundene genetische Veränderung automatisch für die Entstehung oder das Wachstum des Tumors verantwortlich. Bei der molekularen Analyse ist deshalb besonders wichtig zu unterscheiden, welche Veränderungen lediglich Begleiterscheinungen sind und welche als sogenannte Treiberveränderungen das Tumorwachstum fördern.
Das NGS kann dabei unter anderem verschiedene Arten genetischer Veränderungen erkennen.
1. Punkt Mutationen
Bei einer Punktmutation wird eine einzelne Base der DNA-Sequenz verändert. Beispielsweise kann an einer bestimmten Position ein A, T, G oder C durch eine andere Base ersetzt werden.
Eine solche Veränderung kann dazu führen, dass sich die Information für das entsprechende Protein verändert. Wird dadurch eine andere Aminosäure in das Protein eingebaut, kann sich dessen Struktur oder Funktion verändern. Allerdings führt nicht jeder Basenaustausch automatisch zu einer Veränderung des Proteins.
Ein bekanntes Beispiel ist die BRAF-V600E-Mutation, die unter anderem bei schwarzem Hautkrebs vorkommt. Hier wird an Position 600 des BRAF-Proteins die Aminosäure Valin (V) durch Glutaminsäure (E) ersetzt. Diese Veränderung kann dazu führen, dass das BRAF-Protein dauerhaft aktiviert ist und kontinuierlich Wachstumssignale innerhalb der Zelle weitergibt.
Eine solche molekulare Veränderung kann ein wichtiger Angriffspunkt für eine zielgerichtete Therapie sein. Dabei wird versucht, die durch die Mutation überaktivierte Signalübertragung gezielt zu hemmen.
Quellen:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26825657
2. Insertionen und Deletionen
Bei einer Insertion werden eine oder mehrere Basen in die DNA-Sequenz eingefügt. Bei einer Deletion gehen eine oder mehrere Basen verloren.
Je nach Größe und Position der Veränderung kann dies die Funktion des betroffenen Gens erheblich verändern. Werden beispielsweise Basen eingefügt oder entfernt und ist ihre Anzahl kein Vielfaches von drei, kann sich der gesamte Leserahmen eines Gens verschieben. Man spricht dann von einer sogenannten Frameshift-Mutation.
Das Ergebnis kann ein stark verändertes oder vorzeitig abgebrochenes Protein sein, das seine ursprüngliche Funktion nicht mehr erfüllen kann.
Ein Beispiel sind Deletionen im Exon 19 des EGFR-Gens, die bei bestimmten Formen von Lungenkrebs vorkommen. Durch die Veränderung der DNA-Sequenz verändert sich auch die Struktur des EGFR-Proteins. In bestimmten Fällen kann dies dazu führen, dass der Rezeptor dauerhaft aktiviert ist und Wachstumssignale an die Zelle weitergibt.
Auch solche Veränderungen können für eine zielgerichtete Therapie relevant sein, da sich die durch die genetische Veränderung entstandene Überaktivität des EGFR-Signalwegs gezielt hemmen lässt.
Quellen:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35151115
3. Amplifikationen – Gen-Vervielfältigung
Bei einer Amplifikation ist ein bestimmter Abschnitt der DNA in deutlich erhöhter Kopienzahl vorhanden. Die Basenabfolge des Gens muss dabei nicht verändert sein – es gibt vielmehr mehr Kopien dieses Gens oder Genabschnitts, als normalerweise vorhanden wären.
Durch die erhöhte Kopienzahl kann die Zelle unter Umständen deutlich mehr RNA und dadurch auch mehr von dem entsprechenden Protein produzieren.
Ein bekanntes Beispiel ist die HER2-Amplifikation bei bestimmten Brust- sowie Magen- und Speiseröhrenkrebsen. Durch die erhöhte Zahl an HER2-Genkopien kann sich auch die Menge des HER2-Proteins auf der Oberfläche der Tumorzellen stark erhöhen. HER2 kann dadurch verstärkt Wachstumssignale vermitteln und zur Tumorentwicklung beitragen.
Wenn eine solche Amplifikation nachgewiesen wird, kann sie eine wichtige Information für die Therapieentscheidung darstellen. In diesem Fall können Behandlungen eingesetzt werden, die gezielt gegen das dadurch vermehrt vorhandene beziehungsweise überaktive Zielprotein gerichtet sind.
Quelle:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21505336
Warum RNA-Sequenzierung Genfusionen besonders gut sichtbar machen kann
Mithilfe der Analyse der Tumor-RNA lassen sich bestimmte Genfusionen häufig leichter nachweisen als auf DNA-Ebene. Bei einer Genfusion werden DNA-Abschnitte, die ursprünglich zu unterschiedlichen Genen gehören, durch eine chromosomale Umlagerung miteinander verbunden. Die Bruchstellen liegen dabei häufig in den Introns, also in nicht protein-codierenden Bereichen eines Gens. Diese Abschnitte werden bei der Bildung der reifen RNA durch das sogenannte Spleißen entfernt.
In der RNA findet sich dagegen direkt das entstandene Fusions-Transkript: Die codierenden Abschnitte der beiden ursprünglich getrennten Gene erscheinen miteinander verbunden. Dadurch kann die Sequenzierungssoftware häufig sehr direkt erkennen, dass eine Genfusion vorliegt.
Auch wenn die zugrunde liegende Veränderung auf DNA-Ebene entstanden ist, kann ihr Nachweis dort schwieriger sein. Der Grund liegt unter anderem in der teilweise sehr großen und komplexen Struktur der Introns, die sich über viele tausend Basen erstrecken können und teilweise repetitive Sequenzen enthalten.
Quellen:
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6859817
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6437215
https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/cgci/using-cgci/technology
Gewebespezifisch oder tumoragnostisch?
Bei bestimmten Genen treten charakteristische bzw. wiederkehrende chromosomale Brüche und Umlagerungen auf. Sie können dazu führen, dass immer wieder dieselben oder ähnliche Genfusionen entstehen. Manche dieser Genfusionen sind eng mit einer bestimmten Krebsart verbunden, andere können in ganz unterschiedlichen Tumorarten auftreten.
Die moderne Pharmaforschung konnte gezielt Medikamente entwickeln, die die durch solche Genfusionen entstandenen krankheitsfördernden Proteine oder Signalwege blockieren. Damit wird die Genfusion selbst zu einem möglichen therapeutischen Angriffspunkt.
Für das Verständnis ihrer Bedeutung in der Präzisionsmedizin kann man Genfusionen vereinfacht in zwei Gruppen betrachten:
1. Gewebespezifische Genfusionen
Diese Fusionen treten überwiegend bei einer bestimmten Krebsart auf und können ein charakteristisches molekulares Merkmal dieser Erkrankung darstellen.
Ein klassisches Beispiel ist das Philadelphia-Chromosom (BCR::ABL1) bei der chronischen myeloischen Leukämie (CML).
Bei mehr als 95 Prozent der Patienten mit CML findet sich diese charakteristische chromosomale Veränderung. Dabei werden Teile der Chromosomen 9 und 22 ausgetauscht. Das ABL1-Gen von Chromosom 9 wird mit dem BCR-Gen auf Chromosom 22 verbunden. Dadurch entsteht das Fusionsgen BCR::ABL1. Das daraus hervorgehende Fusionsprotein besitzt eine dauerhaft aktivierte Tyrosinkinase und fördert die unkontrollierte Vermehrung der Leukämiezellen.
Heute können sogenannte Tyrosinkinase-Inhibitoren die Aktivität dieses BCR::ABL1-Fusionsproteins gezielt blockieren. Durch diese zielgerichtete Therapie hat sich die Prognose der CML grundlegend verändert. Für die meisten Patienten mit chronischer CML ist die Erkrankung heute langfristig kontrollierbar, und die Lebenserwartung kann sich derjenigen der Allgemeinbevölkerung annähern.
Quellen:
https://www.cancer.gov/types/leukemia/hp/cml-treatment-pdq
https://www.cancer.gov/research/progress/discovery/gleevec
2. Tumoragnostische Genfusionen
Andere Genfusionen sind nicht an ein bestimmtes Organ gebunden. Sie können bei unterschiedlichen Krebsarten auftreten und dort als sogenannte Driver-Alterationen wirken. Für diese Tumoren ist die entscheidende Frage nicht allein, wo der Krebs entstanden ist, sondern welche molekulare Veränderung ihn antreibt.
Bei bestimmten tumoragnostischen Genfusionen kann deshalb dieselbe zielgerichtete Therapie bei unterschiedlichen Krebsarten eingesetzt werden. Voraussetzung ist, dass die entsprechende therapeutisch relevante molekulare Veränderung nachgewiesen wurde.
NTRK-Fusionen können bei zahlreichen unterschiedlichen Tumorarten vorkommen, unter anderem bei Lungen-, Schilddrüsen- und Darmtumoren. In den meisten dieser häufigen Krebsarten sind sie allerdings selten.
Gerade deshalb ist es wichtig, solche genetischen Veränderungen gezielt zu erkennen. Wird eine NTRK-Genfusion nachgewiesen, kann unter bestimmten Voraussetzungen eine zielgerichtete Behandlung mit einem TRK-Inhibitor infrage kommen, unabhängig davon, in welchem Organ der Tumor entstanden ist. Diese Wirkstoffe richten sich gegen die durch die Genfusion entstandene, fehlregulierte Aktivität des TRK-Proteins. Entscheidend für die Therapieauswahl ist damit nicht allein die Art des Tumors, sondern auch, welche molekularen Veränderungen in den Tumorzellen nachgewiesen werden und ob sich daraus eine konkrete therapeutische Option ableiten lässt.
Damit verändert sich die Sicht auf Krebs: Die Frage „Wo ist der Tumor entstanden?“ entscheidet nicht mehr ausschließlich über die Behandlung. Stattdessen lautet die Frage auch: „Welche molekulare Veränderung treibt diesen Tumor an und gibt es ein Medikament, das genau dort ansetzen kann?“
Quellen:
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7903287
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42090631
https://www.onkopedia.com/de/onkopedia/guidelines/praezisionsonkologie/@@guideline/html/index.html
Was beim NGS gemacht wird
Grob vereinfacht lässt sich ein NGS-Verfahren in vier wesentliche Schritte unterteilen. Je nach Sequenzierungstechnologie und danach, ob DNA oder RNA untersucht wird, kann der genaue Ablauf variieren.
1. Fragmentierung
Bei einer DNA-basierten NGS-Untersuchung wird die DNA zunächst in kleinere Fragmente zerlegt. Dies kann beispielsweise mithilfe von Enzymen, durch Ultraschall (Sonikation) oder durch transposase-basierte Verfahren erfolgen (Transposase = Enzym, das von einem Transposon-Gen codiert wird).
Bei einer RNA-basierten Untersuchung wird zunächst die RNA aus dem Tumorgewebe isoliert. Da RNA weniger stabil ist als DNA und nicht direkt mit allen Sequenzierungsplattformen untersucht werden kann, wird sie in der Regel zunächst in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Diese cDNA kann anschließend für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek verwendet werden.
2. Adapter Ligation und Aufbau der DNA Bibliothek
An die DNA- bzw. cDNA-Fragmente werden kurze, speziell hergestellte DNA-Sequenzen, sogenannte Adapter, angefügt.
Diese ermöglichen unter anderem die Bindung der Fragmente an das verwendete Sequenziergerät und die anschließende Verarbeitung.
Die Gesamtheit der so vorbereiteten DNA- bzw. cDNA-Fragmente wird als Sequenzierungsbibliothek (Library)bezeichnet.
3. Amplifikation und Sequenzierung
Je nach verwendeter Technologie werden die Fragmente vervielfältigt, sodass genügend Kopien für die anschließende Messung vorhanden sind. Bei bestimmten Sequenzierverfahren entstehehn dabei sogenannte DNA-Cluster, die aus vielen identischen Kopien eines DNA-Fragments bestehen.
Anschließend wird die Sequenz der Fragmente bestimmt. Dabei wird die Reihenfolge der vier DNA-Bausteine Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) ermittelt. Bei einer RNA-Untersuchung wird entsprechend die aus der RNA gewonnene cDNA sequenziert.
Die Sequenzierplattform erzeugt dabei zunächst Messsignale, aus denen die Software die jeweilige Basenfolge ermittelt.
4. Bioinformatische Datenanalysise
Die Sequenzierung erzeugt eine große Menge an Daten, die anschließend bioinformatisch verarbeitet und analysiert werden. Dabei werden die ermittelten Sequenzen beispielsweise mit einer Referenzsequenz des menschlichen Genoms verglichen, um genetische Veränderungen zu identifizieren.
Bei Tumor-NGS können je nach Untersuchungsmethode unter anderem Mutationen, Genfusionen, Veränderungen der Genkopienzahl oder andere relevante molekulare Veränderungen erkannt werden.
Bei einer RNA-Sequenzierung können insbesondere Veränderungen der tatsächlich in der Zelle abgelesenen Gene sichtbar werden. Das ist beispielsweise für den Nachweis bestimmter Genfusionen von besonderer Bedeutung: Während die zugrunde liegende Veränderung auf DNA-Ebene möglicherweise schwer zu erkennen ist, kann sich in der RNA ein deutlich erkennbares Fusions-Transkript zeigen.
Die gefundenen Veränderungen können anschließend hinsichtlich ihrer biologischen und möglichen therapeutischen Bedeutung bewertet werden. Dabei wird beispielsweise untersucht, ob eine bestimmte Veränderung als treibende Veränderung des Tumors bekannt ist und ob sich daraus eine therapeutische Option ableiten lässt.
Quellen:
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4351865
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9291972
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6476432
Warum NGS sinnvoll ist
Klassische Untersuchungsverfahren wie Immunhistochemie (IHC), FISH oder PCR untersuchen gezielt nach bestimmten molekularen Veränderungen bzw. biologischen Merkmalen. NGS (Next-Generation Sequencing) ermöglicht dagegen, gleichzeitig zahlreiche Gene und unterschiedliche genetische Veränderungen zu analysieren.
Diese umfangreiche Analyse kann helfen, die Behandlung gezielter auf die individuellen molekularen Eigenschaften des Tumors abzustimmen.
Lange Zeit wurde Krebs vor allem danach beurteilt, in welchem Gewebe im Körper der Tumor entstanden ist und welchem Tumortyp er angehört. Patienten mit derselben Krebsart erhielten deshalb häufig ähnliche Therapien. Die individuellen biologischen Unterschiede der Tumoren konnten dabei nur begrenzt berücksichtigt werden. So konnte beispielsweise bei Patient A ein Medikament den Tumor zum Schrumpfen bringen, während es bei Patient B nicht wirkte und Patient C unter erheblichen Nebenwirkungen litt.
Je nach Test können hunderte krebsrelevanter Gene gleichzeitig analysiert werden. Das Ergebnis liefert dem behandelnden Arzt eine Art molekularen „Fingerabdruck“ des Tumors.
Die NGS-Analyse liefert dem Arzt somit zusätzliche molekulare Informationen über den Tumor.
Diese können zusammen mit der Krebsart, dem Tumorstadium, weiteren Untersuchungsergebnissen und den individuellen Voraussetzungen des Patienten in die Entscheidung über die geeignete Behandlung einfließen.
Quellen:
https://www.cancer.gov/publications/pdq/information-summaries/genetics/overview-hp-pdq