Le séquençage de nouvelle génération (NGS): quelques notions de base
Le séquençage de nouvelle génération (Next-Generation Sequencing, NGS) est une technique moderne qui permet de séquencer et d’analyser simultanément l’ADN et l’ARN à l’aide d’outils informatiques. En oncologie, le NGS est notamment utilisé pour pour étudier aussi précisément que possible les caractéristiques moléculaires d’une tumeur.
L’analyse du génome tumoral permet d’identifier des altérations génétiques susceptibles de jouer un rôle dans la croissance et le développement d’une tumeur. Ces informations contribuent à mieux comprendre ses caractéristiques biologiques et à repérer des altérations pouvant avoir une importance pour le traitement.
Le NGS constitue ainsi un outil important de l’oncologie de précision. Les décisions thérapeutiques ne reposent plus uniquement sur l’organe dans lequel la tumeur est apparue, mais tiennent de plus en plus compte des altérations moléculaires propres aux cellules tumorales
Qu’est-ce que le génome ?
Le génome désigne l’ensemble de l’information génétique d’un organisme vivant. Pour simplifier, on peut le comparer au « plan de construction » biologique du corps.
Chez l’être humain, cette information est présente dans les cellules somatiques, c’est-à-dire les cellules du corps, sous la forme de 23 paires de chromosomes, soit 46 chromosomes au total. Les cellules germinales – les ovules et les spermatozoïdes – ne contiennent en revanche qu’un seul jeu de 23 chromosomes. Elles sont donc haploïdes, tandis que les cellules somatiques sont diploïdes.
Les chromosomes sont constitués d’ADN (acide désoxyribonucléique) étroitement associé à des protéines, notamment les histones. L’ADN contient de nombreux gènes. Pour simplifier, un gène est une portion spécifique d’ADN située à un emplacement précis, appelé locus génique, qui contient l’information nécessaire à la production d’un produit fonctionnel, par exemple une protéine ou un ARN fonctionnel.
Sur le plan chimique, l’ADN est constitué de quatre bases azotées différentes : l’adénine (A), la thymine (T), la guanine (G) et la cytosine (C). Chaque base est liée à une molécule de sucre, appelée désoxyribose, ainsi qu’à un groupement phosphate. Ces trois éléments réunis forment un nucléotide, l’unité de base de l’ADN.
L’ADN se présente principalement sous la forme d’un double brin enroulé en double hélice. Les deux brins sont reliés par des bases complémentaires : l’adénine s’apparie avec la thymine (A–T) et la guanine avec la cytosine (G–C). Ces appariements sont rendus possibles par des liaisons hydrogène. Cette structure complémentaire permet notamment à la cellule de recopier fidèlement l’information génétique.
Un gène codant une protéine comprend généralement différentes régions fonctionnelles. Celles-ci incluent notamment des régions régulatrices, comme le promoteur, qui joue un rôle essentiel dans l’initiation de la transcription, ainsi qu’une région transcrite comprenant des exons et, pour de nombreux gènes, des introns. À la fin de la transcription, des signaux de terminaison permettent à l’ARN polymérase de mettre fin au processus. Les exons correspondent aux segments qui subsistent dans l’ARN messager mature après la maturation de l’ARN. Dans les gènes codant des protéines, ils contiennent les séquences codantes nécessaires à la production de la protéine. Les introns, en revanche, sont éliminés du pré-ARN messager lors de l’épissage.
La taille des gènes varie considérablement. Certains ne comptent que quelques centaines de nucléotides, tandis que d’autres s’étendent sur des millions de bases. Le génome humain contient environ 20 000 gènes codant des protéines. À cela s’ajoutent de nombreux gènes qui produisent des ARN fonctionnels non codants. Le nombre exact dépend donc également de la définition du gène retenue et des catégories de gènes prises en compte.
Chez l’être humain, l’ADN se trouve principalement dans le noyau cellulaire. Une petite partie de l’information génétique est également présente dans les mitochondries.
Sources :
https://www.genome.gov/genetics-glossary/Genome
https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Deoxyribonucleic-Acid-Fact-Sheet
De l’ADN à l’ARN
L’ARN (acide ribonucléique) joue un rôle central dans l’expression de l’information génétique. Comme l’ADN, il est constitué de nucléotides. Toutefois, son sucre est le ribose et, à la place de la base thymine (T), l’ARN contient de l’uracile (U). Les quatre bases de l’ARN sont donc l’adénine (A), l’uracile (U), la guanine (G) et la cytosine (C).
Lors de la transcription, l’information contenue dans une portion d’ADN est copiée sous la forme d’une séquence d’ARN grâce à une enzyme appelée ARN polymérase. Dans le cas d’un gène codant une protéine, le produit initial est un pré-ARN messager (pré-ARNm), qui contient encore les exons et les introns.
Ce pré-ARNm subit ensuite plusieurs étapes de maturation pour devenir un ARN messager mature (ARNm). Parmi celles-ci figure notamment l’épissage, au cours duquel les introns sont éliminés et les exons restants sont reliés entre eux. Une coiffe en 5′ et une queue poly(A) sont également ajoutées. Ces modifications contribuent notamment à la stabilité de l’ARNm, ainsi qu’à sa maturation et à son utilisation ultérieure dans la cellule.
L’ARNm mature peut alors quitter le noyau cellulaire et rejoindre le cytoplasme. Là, son information génétique est traduite en protéine par les ribosomes. Ce processus est appelé traduction.
L’ADN et l’ARN se distinguent non seulement par leur composition chimique, mais aussi par leur structure et leur fonction. Dans les conditions physiologiques, l’ADN se présente principalement sous la forme d’une double hélice stable et sert avant tout de support à long terme de l’information génétique. L’ARN est généralement constitué d’un seul brin et peut adopter des structures très diverses, selon sa fonction. L’ARNm constitue ainsi une copie temporaire de l’information portée par un gène et sert de modèle pour la synthèse de protéines spécifiques.
Sources :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26887
Le NGS en oncologie aujourd’hui
On sait aujourd’hui que le cancer est lié à des altérations du matériel génétique. Celles-ci peuvent toucher des gènes qui régulent la croissance et la division des cellules. Certaines altérations génétiques peuvent entraîner une prolifération incontrôlée des cellules et conduire à la formation d’une tumeur.
Le NGS permet d’analyser aussi bien l’ADN que l’ARN d’une tumeur. Pour cela, on examine généralement un échantillon de tissu tumoral. L’objectif est de caractériser aussi précisément que possible les altérations moléculaires de la tumeur et de déterminer lesquelles pourraient jouer un rôle dans sa croissance.
L’oncologie a ainsi évolué vers une approche de précision. Au lieu de se fonder uniquement sur le type de cancer et l’organe touché, il est de plus en plus possible de prendre également en compte les caractéristiques moléculaires propres à chaque tumeur. Les résultats de l’analyse NGS peuvent ainsi contribuer à orienter le traitement de manière plus ciblée, en fonction des caractéristiques biologiques de la tumeur concernée.
Sources :
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9588890
https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing
https://www.cancer.gov/ccg/research/cancer-genomics-overview
https://www.esmo.org/insights-by-esmo
Ce que révèle l’ADN tumoral
L’analyse de l’ADN tumoral fournit des informations sur les altérations génétiques présentes dans le matériel génétique des cellules tumorales. Pour simplifier, on peut parler d’« erreurs durables dans le plan de construction ».
Cela signifie que la séquence d’ADN de la cellule tumorale a changé. Lorsqu’une telle altération est présente dans une cellule tumorale, elle est en principe transmise aux cellules filles lors des divisions cellulaires successives. L’altération peut ainsi se propager au sein de la tumeur.
Toutefois, les altérations génétiques détectées ne sont pas toutes nécessairement responsables de l’apparition ou de la croissance de la tumeur. L’analyse moléculaire doit donc permettre de distinguer les altérations qui sont de simples événements associés à la tumeur de celles qui, appelées altérations conductrices (driver alterations), contribuent à sa croissance.
Le NGS permet notamment de détecter différents types d’altérations génétiques.
1. Les mutations ponctuelles
Une mutation ponctuelle correspond à une modification d’une seule base dans la séquence d’ADN. À une position donnée, une base A, T, G ou C peut, par exemple, être remplacée par une autre base.
Une telle modification peut altérer l’information nécessaire à la synthèse de la protéine correspondante. Si elle entraîne l’incorporation d’un acide aminé différent dans la protéine, la structure ou la fonction de celle-ci peut être modifiée. Toutefois, un changement de base n’entraîne pas systématiquement une modification de la protéine.
Un exemple bien connu est la mutation BRAF V600E, que l’on retrouve notamment dans le mélanome, une forme de cancer de la peau. À la position 600 de la protéine BRAF, l’acide aminé valine (V) est remplacé par l’acide glutamique (E). Cette modification peut entraîner une activation permanente de la protéine BRAF, qui transmet alors continuellement des signaux stimulant la croissance cellulaire.
Une telle altération moléculaire peut constituer une cible importante pour une thérapie ciblée. L’objectif est alors d’inhiber spécifiquement la voie de signalisation devenue hyperactive à la suite de cette mutation.
Sources :
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26825657
2. Les insertions et les délétions
Une insertion correspond à l’ajout d’une ou de plusieurs bases dans la séquence d’ADN. Une délétion, en revanche, désigne la perte d’une ou de plusieurs bases.
Selon la taille et la position de l’altération, la fonction du gène concerné peut être considérablement modifiée. Par exemple, lorsque des bases sont ajoutées ou supprimées en un nombre qui n’est pas un multiple de trois, le cadre de lecture du gène peut être décalé. On parle alors d’une mutation par décalage du cadre de lecture, ou frameshift.
Il peut en résulter une protéine fortement modifiée ou dont la synthèse s’interrompt prématurément, l’empêchant ainsi de remplir sa fonction initiale.
Un exemple est celui des délétions de l’exon 19 du gène EGFR, que l’on retrouve dans certaines formes de cancer du poumon. La modification de la séquence d’ADN entraîne également une modification de la structure de la protéine EGFR. Dans certains cas, cela peut conduire à une activation permanente du récepteur, qui transmet alors des signaux stimulant la croissance cellulaire.
Ces altérations peuvent elles aussi présenter un intérêt pour une thérapie ciblée, car il est possible d’inhiber spécifiquement l’hyperactivité de la voie de signalisation EGFR provoquée par l’altération génétique.
Sources :
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35151115
3. Les amplifications : multiplication du nombre de copies d’un gène
Lors d’une amplification, un segment précis d’ADN est présent en un nombre de copies nettement supérieur à la normale. La séquence d’ADN du gène lui-même ne change pas nécessairement. Il existe plutôt davantage de copies du gène ou du segment de gène que prévu habituellement.
Cette augmentation du nombre de copies peut conduire la cellule à produire davantage d’ARN et, par conséquent, une plus grande quantité de la protéine correspondante.
Un exemple bien connu est l’amplification du gène HER2 dans certaines formes de cancer du sein, de l’estomac et de l’œsophage. L’augmentation du nombre de copies du gène HER2 peut entraîner une hausse importante de la quantité de protéine HER2 présente à la surface des cellules tumorales. Le récepteur HER2 peut alors transmettre des signaux de croissance plus intenses et contribuer au développement de la tumeur.
La détection d’une telle amplification peut constituer une information importante pour le choix du traitement. Elle peut notamment permettre d’envisager des thérapies ciblant spécifiquement la protéine dont la quantité est devenue excessive ou dont l’activité contribue à la croissance tumorale.
Sources :
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21505336
Pourquoi le séquençage de l’ARN permet de mieux détecter les fusions géniques
L’analyse de l’ARN tumoral permet souvent de détecter certaines fusions géniques plus facilement qu’une analyse de l’ADN. Lors d’une fusion génique, des segments d’ADN appartenant initialement à des gènes différents sont réunis à la suite d’un réarrangement chromosomique. Les points de cassure se situent fréquemment dans les introns, c’est-à-dire dans des régions non codantes des gènes. Lors de la maturation de l’ARN, ces segments sont éliminés par un processus appelé épissage.
En revanche, l’ARN contient directement le transcrit de fusion qui en résulte : les séquences codantes des deux gènes initialement distincts se retrouvent réunies. Le logiciel de séquençage peut ainsi souvent identifier plus directement la présence d’une fusion génique.
Même si l’altération à l’origine de cette fusion se produit au niveau de l’ADN, sa détection peut être plus difficile à ce niveau. Cela s’explique notamment par la structure parfois très longue et complexe des introns, qui peuvent s’étendre sur plusieurs milliers de bases et contenir des séquences répétitives. Lors de l’analyse de l’ARN, ces régions ont déjà été éliminées, ce qui peut rendre la jonction entre les séquences codantes impliquées dans la fusion beaucoup plus facile à repérer.
Sources :
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6859817
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6437215
https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/cgci/using-cgci/technology
Spécifiques d’un tissu ou indépendantes du type de tumeur ?
Certains gènes présentent des cassures chromosomiques et des réarrangements caractéristiques ou récurrents. Ceux-ci peuvent conduire à la formation répétée de fusions géniques identiques ou similaires. Certaines de ces fusions sont étroitement associées à un type de cancer particulier, tandis que d’autres peuvent apparaître dans des types de tumeurs très différents.
Les progrès de la recherche pharmaceutique ont permis de développer des médicaments conçus spécifiquement pour bloquer les protéines ou les voies de signalisation favorisant la maladie et produites à la suite de telles fusions géniques. La fusion elle-même peut ainsi devenir une cible thérapeutique potentielle.
Pour mieux comprendre leur importance en médecine de précision, on peut distinguer, de manière simplifiée, deux catégories de fusions géniques :
1. Les fusions géniques spécifiques d’un tissu
Ces fusions apparaissent principalement dans un type de cancer particulier et peuvent constituer une caractéristique moléculaire typique de cette maladie.
Un exemple classique est le chromosome de Philadelphie (BCR::ABL1), caractéristique de la leucémie myéloïde chronique (LMC).
Chez plus de 95 % des patients atteints de LMC, on retrouve cette anomalie chromosomique caractéristique. Elle résulte d’un échange de segments entre les chromosomes 9 et 22. Le gène ABL1, situé sur le chromosome 9, se retrouve associé au gène BCR, situé sur le chromosome 22. Il en résulte le gène de fusion BCR::ABL1. La protéine de fusion ainsi produite possède une activité tyrosine kinase activée en permanence, qui favorise la prolifération incontrôlée des cellules leucémiques.
Aujourd’hui, des médicaments appelés inhibiteurs de tyrosine kinase peuvent bloquer spécifiquement l’activité de cette protéine de fusion BCR::ABL1. Grâce à cette thérapie ciblée, le pronostic de la LMC a été profondément transformé. Pour la plupart des patients atteints de LMC en phase chronique, la maladie peut désormais être contrôlée à long terme, et leur espérance de vie peut se rapprocher de celle de la population générale.
Sources :
https://www.cancer.gov/types/leukemia/hp/cml-treatment-pdq
https://www.cancer.gov/research/progress/discovery/gleevec
2. Les fusions géniques indépendantes du type de tumeur (tumour-agnostic)
D’autres fusions géniques ne sont pas liées à un organe en particulier. Elles peuvent apparaître dans différents types de cancer et agir comme des altérations conductrices, ou driver alterations. Pour ces tumeurs, la question déterminante n’est donc pas uniquement de savoir où le cancer est apparu, mais aussi quelle altération moléculaire est à l’origine de son développement.
Dans le cas de certaines fusions géniques dites tumor-agnostic, une même thérapie ciblée peut ainsi être utilisée pour traiter différents types de cancer. Cela suppose que l’altération moléculaire concernée, présentant un intérêt thérapeutique, ait été identifiée.
Les fusions des gènes NTRK en sont un exemple particulièrement parlant. Les gènes NTRK1, NTRK2 et NTRK3 peuvent fusionner avec de nombreux gènes partenaires différents. Cette fusion peut entraîner une activation permanente du domaine tyrosine kinase de la protéine NTRK, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Pour simplifier, on peut dire qu’un interrupteur moléculaire stimulant la croissance cellulaire reste constamment en position « marche ».
Les fusions NTRK peuvent être présentes dans de nombreux types de tumeurs, notamment les cancers du poumon, de la thyroïde et de l’intestin. Elles restent toutefois rares dans la plupart de ces cancers fréquents.
C’est précisément pour cette raison qu’il est important d’identifier ces altérations génétiques de manière ciblée. Lorsqu’une fusion d’un gène NTRK est détectée, un traitement ciblé par un inhibiteur de TRK peut être envisagé sous certaines conditions, indépendamment de l’organe dans lequel la tumeur est apparue. Ces médicaments agissent contre l’activité dérégulée de la protéine TRK résultant de la fusion génique. Le choix du traitement ne dépend donc pas uniquement du type de tumeur, mais aussi des altérations moléculaires identifiées dans les cellules tumorales et de la possibilité d’en déduire une option thérapeutique concrète.
Cette approche transforme notre manière d’appréhender le cancer. La question « Dans quel organe la tumeur est-elle apparue ? » ne détermine plus à elle seule le traitement. Une autre question devient tout aussi importante : « Quelle altération moléculaire stimule la croissance de cette tumeur, et existe-t-il un médicament capable d’agir précisément sur ce mécanisme ? »
Sources :
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7903287
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42090631
https://www.onkopedia.com/de/onkopedia/guidelines/praezisionsonkologie/@@guideline/html/index.html
Comment se déroule une analyse NGS
De manière simplifiée, une analyse NGS peut être divisée en quatre grandes étapes. La procédure exacte varie selon la technologie de séquençage utilisée et selon que l’on analyse de l’ADN ou de l’ARN.
1. Fragmentation
Lors d’une analyse NGS basée sur l’ADN, celui-ci est d’abord découpé en fragments plus petits. Cette fragmentation peut notamment être réalisée à l’aide d’enzymes, par ultrasons (sonication) ou au moyen de méthodes faisant appel à des transposases, des enzymes codées par des gènes de transposons.
Dans le cadre d’une analyse basée sur l’ARN, celui-ci est d’abord extrait du tissu tumoral. Comme l’ARN est moins stable que l’ADN et ne peut pas être analysé directement sur toutes les plateformes de séquençage, il est généralement converti en ADN complémentaire (ADNc, ou cDNA en anglais). Cet ADNc peut ensuite être utilisé pour préparer la bibliothèque de séquençage.
2. Ligation des adaptateurs et préparation de la bibliothèque d’ADN
De courtes séquences d’ADN spécialement conçues, appelées adaptateurs, sont ajoutées aux fragments d’ADN ou d’ADNc.
Elles permettent notamment aux fragments de se fixer au dispositif de séquençage utilisé et d’être traités lors des étapes suivantes.
L’ensemble des fragments d’ADN ou d’ADNc ainsi préparés constitue la bibliothèque de séquençage (library).
3. Amplification et séquençage
Selon la technologie utilisée, les fragments sont amplifiés afin de disposer d’un nombre suffisant de copies pour la mesure. Dans certaines méthodes de séquençage, cette étape produit des clusters d’ADN, constitués de nombreuses copies identiques d’un même fragment d’ADN.
La séquence des fragments est ensuite déterminée. Il s’agit d’identifier l’ordre des quatre bases de l’ADN : l’adénine (A), la cytosine (C), la guanine (G) et la thymine (T). Lors d’une analyse de l’ARN, c’est l’ADNc obtenu à partir de l’ARN qui est séquencé.
La plateforme de séquençage génère d’abord des signaux de mesure, que le logiciel interprète ensuite pour déterminer la séquence de bases correspondante.
4. Analyse bioinformatique des données
Le séquençage génère une grande quantité de données, qui sont ensuite traitées et analysées à l’aide de méthodes bioinformatiques. Les séquences obtenues sont notamment comparées à une séquence de référence du génome humain afin d’identifier d’éventuelles altérations génétiques.
Selon la méthode d’analyse utilisée, le NGS tumoral peut détecter des mutations, des fusions géniques, des variations du nombre de copies de gènes et d’autres altérations moléculaires pertinentes.
Les altérations identifiées peuvent ensuite être évaluées en fonction de leur signification biologique et de leur intérêt potentiel pour le traitement.
Sources :
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4351865
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9291972
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6476432
Pourquoi le NGS est utile
Les méthodes d’analyse classiques, telles que l’immunohistochimie (IHC), l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) ou la PCR, recherchent de manière ciblée des altérations moléculaires ou des caractéristiques biologiques spécifiques. Le NGS (Next-Generation Sequencing), en revanche, permet d’analyser simultanément de nombreux gènes et différents types d’altérations génétiques.
Cette analyse approfondie peut contribuer à adapter plus précisément le traitement aux caractéristiques moléculaires propres à chaque tumeur.
Pendant longtemps, le cancer a été évalué principalement en fonction du tissu dans lequel la tumeur était apparue et du type de cancer auquel elle appartenait. Les patients atteints du même type de cancer recevaient donc souvent des traitements similaires. Les différences biologiques propres à chaque tumeur ne pouvaient être prises en compte que de manière limitée. Ainsi, un médicament pouvait, par exemple, entraîner une régression de la tumeur chez le patient A, rester sans effet chez le patient B et provoquer des effets indésirables importants chez le patient C.
Aujourd’hui, le NGS représente une avancée importante vers une oncologie de précision personnalisée. En effet, deux personnes atteintes, par exemple, d’un cancer du poumon peuvent présenter des tumeurs très différentes sur le plan moléculaire. Selon le test utilisé, plusieurs centaines de gènes impliqués dans le cancer peuvent être analysés simultanément.
Selon le test utilisé, plusieurs centaines de gènes associés au cancer peuvent être analysés simultanément. Les résultats fournissent au médecin traitant une sorte d’« empreinte moléculaire » de la tumeur. Les altérations identifiées peuvent donner des indications importantes sur la pertinence éventuelle d’un traitement ciblé particulier.
L’analyse NGS fournit ainsi au médecin des informations moléculaires complémentaires sur la tumeur. Celles-ci peuvent être prises en compte dans le choix du traitement le plus approprié, conjointement avec le type de cancer, le stade de la maladie, les autres résultats diagnostiques et la situation individuelle du patient.
Sources :
https://www.cancer.gov/publications/pdq/information-summaries/genetics/overview-hp-pdq